Terapia Génica

El estrés oxidativo en las células endoteliales (EC) puede conducir a la disfunción vascular que es un evento subyacente al desarrollo de la enfermedad  cardiovascular y cerebrovascular. El objetivo de este estudio fue determinar si la cobre/zinc superóxido dismutasa (CuZnSOD o SOD1) después de nanoformulación (nanoSOD) puede reducir el estrés oxidativo de las células endoteliales y además reducir la inflamación vascular en la obesidad.

Células endoteliales aórticas humanas (HAECs) fueron tratados con native- o nanoSOD durante 6 h seguido de un tratamiento con ácido linoleico (LA), un ácido graso libre, durante 6-24 h. Para determinar la relevancia in vivo, la eficacia de nanoSOD en la reducción de la activación de células vascular se estudió en un modelo de ratón de la obesidad inducida por la dieta.

Se obtuvo que nanoSOD fue más efectivamente ocupado por las células endoteliales que SOD nativa. Western blot confirmó, además, que la acumulación intracelular de la proteína SOD1 se incrementó en gran medida con el tratamiento nanoSOD. Es importante destacar que, nanoSOD pretratamiento condujo a una disminución significativa en el estrés oxidativo LA-inducido en células endotelialesque se asoció con un aumento marcado en la actividad de la enzima SOD en células endoteliales. Los estudios in vivo mostraron una disminución significativa en los marcadores de EC/activación de las células vasculares e inflamación en el tejido adiposo visceral (VAT), aorta torácica, y el corazón recogidos de ratones tratados con nanoSOD en comparación con los ratones de control obesos. Curiosamente, la expresión de metalotioneína 2, un gen antioxidante fue significativamente mayor en los ratones tratados con nanoSOD.

Nuestros datos muestran que nanoSOD es muy eficaz en la entrega de SOD activo para células endoteliales y en la reducción de estrés oxidativo. Nuestros datos también demuestran que nanoSOD será una herramienta útil para reducir la activación de las células vasculares del VAT y la aorta en la obesidad, que, a su vez, puede proteger contra las enfermedades cardiovasculares asociadas a la obesidad, en particular, la hipertensión.

Saraswathi V, Ganesan M, Perriotte-Olson C, Manickam DS, Westwood RA, Zimmerman MC, Ahmad IM, Desouza CV, Kabanov AV. Nanoformulated Copper/Zinc Superoxide Dismutase Attenuates Vascular Cell Activation and Aortic Inflammation in Obesity. Biochem Biophys Res Commun. 2015 Dec 12. pii: S0006-291X(15)31032-9.

Terapia de Stem Cells

Las células madre mesenquimales (MSCs) se han utilizado con éxito para el tratamiento de la hemorragia intracerebral experimental (ICH). Sin embargo, no se entienden completamente los mecanismos neuroprotectores a través del cual las MSC mejoran la recuperación funcional neurológica. Se ha comprobado la hipótesis de que el tratamiento con MSC inhibe la inflamación después de ICH y reduce la lesión cerebral posterior. A continuación se realiza una breve revisión de dos diferentes artículos científicos que han utilizado este tipo de stem cells junto con los resultados que obtuvieron.

En el primero las ratas adultas fueron sometidas a inyección estereotáxica de la colagenasa VII se trasplantaron con una subpoblación de MSC derivadas de médula ósea humana (CMMO), denominado quinasa de hígado fetal (Flk) -1 (+) CMMO, y otra solución salina en el parénquima cerebral ipsilateral 1 día después de ICH.

MMO Flk-1 (+) inhibió significativamente la proliferación periférica de células mononucleares de sangre (rPBMCs) inducidas en una reacción mixta de linfocitos. Consistentemente, se encontró un efecto anti-inflamatorio significativo de CMMO en el cerebro ICH, incluyendo una disminución de la infiltración de neutrófilos y la activación microglial en la zona peri-ICH, y regulación a la baja de mediadores inflamatorios, como la interleucina Flk-1 (+) (IL ) -1β, IL-2, IL-4, IL-6 y factor de necrosis tumoral (TNF) -α. Además, Flk-1 + hBMSC tratamiento aumentó significativamente la densidad vascular en la zona peri-ICH. En general, estos datos sugieren un papel esencial para CMMO Flk-1 (+) en la reducción de la infiltración inflamatoria, la promoción de la angiogénesis, y la mejora de la recuperación funcional después de ICH en ratas.

    

En el segundo se utilizó un modelo experimental de rata ICH fue establecido por la administración intraestriatal de la colagenasa. Las ratas fueron divididas aleatoriamente para recibir o bien MSC de rata o PBS por vía intravenosa. Además, se realizaron pruebas de comportamiento utilizando el score de gravedad neurológica modificado (MNSS) siguiente ICH. La inmunohistoquímica se realizó para detectar las MSC BrdU marcado y la expresión de la proteína de la caspasa 2, NF200 y GFAP en los tejidos neuronales. Western Blot y ELISA se realizaron para medir la expresión de la proteína de Akt y bcl-2 o el contenido de proteína de G-CSF y el BDNF. El grupo trasplantado-MSC demostró una mejor función neuronal en la prueba MNSS siguiente ICH en comparación con el grupo control (p <0,05). El grupo MSC-trasplantado también mostró volumen hemorragia reducida a las 24 y 72 h después de ICH. Por vía intravenosa MSC trasplantadas son capaces de mejorar la recuperación funcional y la restauración de los déficits neurológicos en ICH experimental. Los mecanismos están asociados con la supervivencia mejorada y diferenciación de las células neuronales, y el aumento de la expresión de proteínas anti-apoptóticas y factores tróficos.

    

Bao XJ, Liu FY, Lu S, Han Q, Feng M, Wei JJ, Li GL, Zhao RC, Wang RZ. Transplantation of Flk-1+ human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and anti-inflammatory and angiogenesis effects in an intracerebral hemorrhage rat model. Int J Mol Med. 2013 May;31(5):1087-96.

Wang SP, Wang ZH, Peng DY, Li SM, Wang H, Wang XH. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells in rats with intracerebral hemorrhage: reduced apoptosis and enhanced neuroprotection. Mol Med Rep. 2012 Oct;6(4):848-54.

Transgénicos en Enfermedad Cerebrovascular

Mediante un sistema de expresión de Escherichia coli altamente eficiente se obtuvo una cantidad apreciable de péptido antihipertensivo. La secuencia de ADN codificante para el péptido Gly-Val-Tyr-Pro-His-Lys se sintetizó y fue ligado para formar una copia diez en tándem químicamente. Se clonó en el vector pET-15b y se expresó en E. coli BL21 (DE3). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía de afinidad a más de 95% de pureza, y una mayor purificación se logró por cromatografía líquida después de la escisión con tripsina. El producto se identificó mediante ionización por electrospray-espectrometría de masas. Los efectos antihipertensivos del AHP recombinante fueron investigados en ratas espontáneamente hipertensas. Los resultados in vivo han demostrado que una sola administración oral de este péptido en ratas espontáneamente hipertensas resultó en una reducción significativa de la presión arterial sistólica en 2 horas. La presión arterial sistólica se estabilizó 4 horas después y se mantuvo en un nivel bajo durante 24 horas. Lo cual proporciona un método práctico para desarrollar el péptido en alimentos funcionales o medicamentos para la prevención y tratamiento de la hipertensión.

AHP es un buen candidato para preparaciones farmacéuticas debido a un buen efecto antihipertensivo y la falta de efectos secundarios. Sin embargo, AHP que tienen mayor actividad suelen ser pequeños péptidos, por lo general unos pocos o una docena de aminoácidos, y no todos los AHP son adecuados para la expresión por este método. Se eligió el péptido GVYPHK para la expresión recombinante, ya que se obtuvo del autolisado parcialmente purificada de intestino de bonito y tenía efectos antihipertensivos. Muchas publicaciones han reportado el uso de una técnica de expresión de múltiples copias de expresar el pequeño péptido fusionado con diferentes etiquetas.

Wang XL, Ma SN, Yuan YH, Ding Y, Li DS. Expression and purification recombinant antihypertensive peptide ameliorates hypertension in rats with spontaneous hypertension. Protein Expr Purif. 2015 Sep;113:30-4.

ADN Recombinante en Enfermedades Cerebrovasculaes

Como recordarán un tipo de enfermedad cerebrovascular puede ser isquémica y esta se debe al desarrollo de un coágulo que posteriormente ocluye cualquier vaso sanguíneo cerebral, pudiendo ser una enfermedad cerebrovascular trombótico o embólico dependiendo del lugar de desarrollo del coágulo, o puede ser hemorrágica si existe lesión en los vasos de cualquier tipo.

En este post se explicarán dos fármacos que son producto de ADN recombinante, los cuales se enfocan en evitar o ayudar en el desarrollo de un coágulo y con ello disminuir la probabilidad de una enfermedad cerebrovascular, estos fármacos no han sido desarrollados exclusivamente para enfermedades cerebrovasculares pero debemos recordar que estas son secundarias a otro tipo de enfermedades.

rFVIIa (Factor VII activado recombiannte)

El eptacog alfa activado o factor VII activado recombinante (rFVIIa), es un fármaco procoagulante, cuyo modo de acción no está completamente aclarado; pero que parece depender de su capacidad de producir activación plaquetaria, amplificar la producción de trombina e inhibir la fibrinolisis; y cuya actividad parece limitarse a zonas con exposición del FT, lo que reduce el riesgo de trombosis sistémica. El factor VII activo recombinante es un fármaco a considerar en situaciones de sangrado masivo. Su activación tras unirse al factor tisular expuesto da inicio a la cascada de la coagulación mediante la secuencia de acción de los diferentes factores. Desde su aprobación como tratamiento de los episodios hemorrágicos en los pacientes con hemofilia sus indicaciones han ido aumentando, siendo un fármaco con indicaciones en la hemorragia intracraneal no traumática, en los pacientes politraumatizados severos y en aquellas situaciones hemorrágicas que pueden afectar a la viabilidad del paciente. Considerando todos los datos expuestos, el empleo del rFVIIa podría ser especialmente interesante en neurocirugía, y en pacientes neurocríticos. En este sentido, el rFVIIa ha sido evaluado en la hemorragia intracerebral primaria (ictus), en la que los estudios iniciales mostraban unos resultados prometedores; pero un ensayo clínico en fase III sólo probó una reducción del tamaño del hematoma, que, sin embargo, no se acompañó de mayor supervivencia ni de mejor recuperación neurológica.

Estreptoquinasa Recombinante

La aplicación de la estreptoquinasa recombinante en el tratamiento del infarto cerebral isquémico está en fase II. En junio de 1996, la FDA aprobó el uso del activador hístico del plasminógeno para el infarto cerebral isquémico en los Estados Unidos de América basado en los resultados del National Institute of Neurological Disorders and Stroke(NINDS) que utilizó un estricto protocolo y fijó en 3 h el período de ventana terapéutica. En Europa se realizó paralelamente el European Cooperative Acute Stroke Study (ECASS), con un período de ventana terapéutica mayor (6 h), los resultados no fueron tan buenos como los del NINDS; sin embargo cuando se analizaron los que fueron tratados antes de las 3 h, se observó que era recomendable su uso. Posteriormente, se realizó el ECASS-II, que se publicó en octubre de 1998. Este estudio utilizó un protocolo semejante al usado en el NINDS y concluyó que la trombólisis aplicada dentro de las 3 primeras horas puede ser beneficiosa en el tratamiento del infarto cerebral isquémico. Se han efectuado estudios con estreptoquinasa en Europa y Australia con resultados desfavorables, pero se utilizó un período de ventana de 6 h.

M. QUINTANA DÍAZ, M. SÁNCHEZ CASADO, A. GARCÍA DE LORENZO Y MATEOS. Factor VII activado recombinante. Medicina Intensiva. Volume 31, Issue 6, September 2007, Pages 326–330.

I. Ingelmo Ingelmoa, P. Rama-Maceirasb, N. Fàbregas Juliàc, J. Hernández Palazón. Utilización del factor VII activado recombinante en pacientes neuroquirúrgicos y neurocríticos. Revista Española de Anestesiología y Reanimación. Volume 56, Issue 6, 2009, Pages 339–342

Dr. Antonio J. Ruibal León, Dr. Gilberto Durán Torres y Dra. Verónica M. González García. Tratamiento de la enfermedad cerebrovascular en su fase aguda. Rev cubana med v.42 n.2 Ciudad de la Habana abr.-jun. 2003

Enfermedades Cerebrovasculares

Buenas tardes a todos en esta ocasión me permito publicarles un video acerca de la fisiopatología de las enfermedades cerebrovasculares, espero les sea de gran utilidad y pueda resolver mucha de las dudas que tengan, tengan un excelente día.

ADN Recombinante

A continuación vamos a citar dos ejemplos de ADN recombinante tanto uno que encontramos de manera natural en la naturaleza y uno que ha sido obtenido a través de experimentos en laboratorio y ha sido aplicado a la farmacología actual.

Las aflatoxinas son metabolitos secundarios tóxicos principalmente de los hongos Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, los cuales son potentes mutágenos y cancerígenos de los alimentos y la exposición del hombre a ellos es continuo. Las aflatoxinas se ligan al ADN, ARN y proteínas formando aductos AFB₁-ADN que se acumulan por años y dañan desde los virus al hombre, estos aductos actúan como biomarcadores de largo tiempo de riesgo de enfermedad. Las aflatoxinas se activan en presencia del citocromo P₄₅₀ como una molécula inestable 8,9 epóxido AFB, que se liga al N⁷ de la guanina y se transforma en los cancerígenos activos o aductos AFB₁-Gua y finalmente en los aductos AFB₁-FAPY y son una medida objetiva de la exposición humana a cancerígenos ambientales. Los aductos representan la exposición, absorción distribución, metabolismo, reparación del ADN y cambio celular.

El rFVIIa es un fármaco diseñado para promover la hemostasia activando la vía extrínseca de la coagulación. Es una glucoproteína dependiente de vitamina K elaborada bajo técnicas de ADN recombinante clonado y expresado del factor VII de la cascada de la coagulación, que se cultiva en células renales de hámster. El rFVIIa ejerce su acción hemostática, sólo al interactuar con el factor tisular (FT) en el sitio de la lesión, que se encuentra en las capas profundas de la pared vascular. Es proteolíticamente inerte en la circulación y la infusión del fármaco no produce activación sistémica de la coagulación excepto en situaciones especiales. 

Carvajal M. TRANSFORMACIÓN DE LA AFLATOXINA B1 DE ALIMENTOS, EN EL CANCERÍGENO HUMANO, ADUCTO AFB1-ADN. Revista TIP. Volume 16, Issue 2, 2013, Pages 109–120

Emilio Curiel Balseraa, Victoria Santana Parejab, Javier Muñoz Bonoa. Uso compasivo de factor VIIa recombinante en pacientes con hemorragia grave. Elsevier Volume 135, Issue 10, 2 October 2010, Pages 476–477

Prueba Molecular para Enfermedades Cerebrovasculares

A continuación se describirán tres técnicas moleculares que pueden ser de utilidad para el diagnóstico de enfermedades cerebrovasculares, teniendo en cuenta que las dos primeras se utilizan para el diagnostico de la enfermedad cerebrovascular y la ultima se utiliza para el diagnóstico de la enfermedad de Fabry.

El miR-21 es un fuerte factor antiapoptótico en algunos sistemas biológicos. Mediante la utilización de la hibridación in situ (ISH) y microdisección de captura por láser (LCM) en combinación RT-PCR para investigar la expresión de miR-21. ISH reveló que el miR-21 se sobre expresa en las neuronas de la zona de frontera isquémica (IBZ) y análisis en tiempo real RT-PCR cuantitativa reveló que el accidente cerebrovascular aumenta miR-21 niveles 3 veces mayores en las neuronas aisladas de la IBZ por LCM.

En tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) es el método más sensible y específico aplicado para cuantificar niveles circulantes miRNAs, pero se presentan dificultades como: muy poca cantidad de ARN recuperado de suero o plasma y la falta de controles endógenos apropiados para la normalización. Debido a que el ARN extraído de plasma / sérica es muy poco, un procedimiento de normalización es necesario, además drogas para antiplaquetario y anticoagulación pueden afectar la cuantificación de miARN en muestras de sangre.

Se ha desarrollado una nueva aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa-inmuno (PCR) (denominado Tag simultánea múltiple [Mustag]) para la medición del nivel de proteína GLA en muestras de sangre. Se comparó la sensibilidad del método Mustag con placas o perlas magnéticas con las de ELISA para GLA humana recombinante y encontramos que la sensibilidad máxima aparente fue mayor para los primeros que para los segundos, proporcionando una estimación más clara de los niveles de proteína GLA en el suero y plasma con mínima o ningún ruido de fondo.

Sachie Nakano, Yoshihito Morizane, Noriko Makisaka, Toshihiro Suzuki, Tadayasu Togawa, Takahiro Tsukimura, Ikuo Kawashima, Hitoshi Sakuraba, Futoshi Shibasaki. Development of a Highly Sensitive Immuno-PCR Assay for the Measurement of a-Galactosidase A Protein Levels in Serum and Plasma. PLOS ONE November 2013. Volume 8. Issue 11.

Buller B, Liu X, Wang X, Zhang RL, Zhang L, Hozeska-Solgot A, Chopp M, Zhang ZG. MicroRNA-21 protects neurons from ischemic death. FEBS J. 2010 Oct;277(20):4299-307

Meng Li, Junping Zhang. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. 2015;2015:730535.